Oksidaasitestesäätiö, menettely ja käyttö

Se oksidaasitesti Se on diagnostinen menetelmä, joka osoittaa sytokromioksidaasi C -nimisen entsymaattisen kompleksin esiintymisen. Tämä järjestelmä indusoi pelkistetyn hapettuneen sytokromin transformaation, koska se vangitsee happea ja tämä puolestaan ​​toimii viimeisenä elektronia vastaan ​​(H⁺) Hengitysketjussa.

Oksidaasitermi on yhteenveto tapa viitata sytokromioksidaasientsyymiin, joka tunnetaan myös nimellä oksidaasi -defenoli. Muinaisina aikoina uskottiin, että sytokromioksidaasi- ja indeofenolioksidaasientsyymit olivat kaksi erilaista entsyymiä, mutta nykyään tiedetään, että ne ovat samoja.

Positiivinen ja negatiivinen oksidaasitesti. Lähde: Ei konetta luettavissa olevaa kirjailijaa. Alfa.Prim ~ commonswikisi oletettu (perustuen tekijänoikeusvaatimuksiin). [Julkinen verkkotunnus]

Sytokromit puolestaan ​​ovat hemoproteiineja, jotka sisältävät rautaa ja täydentävät sytokromioksidaasijärjestelmää. Sytokromit voivat vaihdella lajista toiseen.

Sytokromien lajikkeita on erilaisia ​​(sytokromit A1, A2, A3 ja 0). Jotkut bakteerit voivat tuottaa vain yhden, mutta toiset jopa kaksi tai kolme samanaikaisesti. Tässä mielessä sytokromi A: n ja A3: n läsnäolo tunnetaan sytokromi -oksidaasi C. Tämä on sytokromityyppi, joka havaitsee oksidaasitestin.

Neisseria- ja Pseudomonas -genrit sisältävät oksidaasi C -sytokromia. Nämä tyylilajit antavat positiivisen oksidaasitestin, joka auttaa erottamaan ne vastaavasti acinetobacter- ja stenotrophomonas -genreistä.

On myös muita tyylilajeja, jotka ovat positiivisia oksidaasi.

[TOC]

Perusta

Sytokromioksidaasijärjestelmän C -ominaisuudet C

Oksidaasikykokromajärjestelmä C toimii seuraavasti: Positiiviset oksidaasimikro -organismit käyttävät happea energian tuottamiseen aerobisen hengityksen kautta. Tämä järjestelmä toimii elektronien kuljetuksen ansiosta luovuttajien aineista, kuten NADH⁺ Kohti aineita, tässä tapauksessa happea.

Tämä johtaa energiaan (ATP) ja vesiperoksidiin riippuen oksidaasisytokromi -järjestelmästä, jolla on mikro -organismeja.

Siksi useimmat positiiviset oksidaasibakteerit ovat myös positiivisia katalaasia, välttämätöntä tilaa tuotetun vetyperoksidin eliminoimiseksi, koska tämä aine on myrkyllinen bakteereille.

Oksidaasi C -sytokromijärjestelmää on läsnä joissakin aerobisissa bakteereissa, tietyissä valinnaisissa anaerobisissa, niukasti mikroaerofiilisissä eikä tiukkoja anaerobisia. Jälkimmäinen on ymmärrettävää, koska tiukat anaerobit eivät voi elää hapen läsnä ollessa, siksi heillä ei ole sytokromioksidaasijärjestelmää.

Todistusperiaate

Tässä testissä käytetään aineita, jotka toimivat keinotekoisina elektronien vastaanottajina, alkuperäiskansojen korvaaminen elektronien kuljetusketjussa.

Käytetään pääasiassa väriaineita, kuten parafenylendiamiinia ja indofenolia.

Sytokromoksidaasi C -järjestelmä hapettuu parafenyndiamiinia. Väriaine pienennetyssä muodossa on väritön, mutta hapettuneessa muodossaan se on värillinen.

Näin sytokromioksidaasi C -järjestelmän C läsnäolo; No, positiivinen reaktio tuottaa laventelin tai sinisen värin -púrpuran käytetystä reagenssista riippuen.

Voi palvella sinua: paleobiologia: historia, erikoisuudet, löytöt

Toisaalta, jos hengitysketjun viimeinen elektronia vastaanottaja -aine on erilainen kuin happea, oksidaasitesti antaa negatiivisesti (värin tuotantoa ei ole); Näin on anaerobisten mikro -organismien tapaus.

Samoin, jos mikro -organismin käyttämä sytokromi on erilainen kuin sytokromioksidaasi C, se antaa myös negatiivisen testin.

Menettely

Oksidaasitestissä on useita reagensseja ja protokollia, kaikki samalla tarkoituksella.

Reagenssit

Kovacs Reactive-, Gordon- ja McLeod -reagenssi, Nadi -reagenssi, puusepän reagenssi, Suhrland ja Morrison sekä oksidaasilevyjen käyttö.

-Kovacs -oksidaasireagenssi

Se koostuu tetrametyyli-P-fenylendiamiinidikloorihydraatista 1%.

Kovacs -reagenssi valmistetaan liuottamalla 1 grammaa ainetta, joka on mainittu 50 ml: n tislattua vettä. Sitä lämmitetään hienovaraisesti sen kokonaisliuokseen. Siirrä riittävän kapasiteetin keltaiseen pulloon ja täytä tilavuus 100 ml: lla tislatulla vedellä. Odota vähintään 15 minuuttia ennen käyttöä. Tallenna jääkaapissa suojattu valolta.

Sitä pyöritetään Kovacs -oksidaasireagenssina sen erottamiseksi Kovacs -reagenssista, jota käytetään indolitestin paljastamiseen. Tämä reagenssi on herkin, vähemmän myrkyllinen, mutta kalliimpi kuin muut reagenssit.

Positiivinen reaktio on todiste. Negatiivinen reaktio näkyy, koska pesäkessä ei ole värinmuutosta tai se vie hieman vaaleanpunaisen värityksen. Väliaine voi myös tummentaa, mutta se ei tarkoita positiivista reaktiota.

Tällä reagenssilla reaktioaika on ratkaisevan tärkeää, että värinmuutosta, joka tapahtuu välillä 5-15 sekuntia, pidetään positiivisena reaktiona.

-Gordon ja McLeod -reagenssi

Se koostuu dimetyyli-P-fenylendiamiinidikloorihydraatista, joka tunnetaan myös nimellä N-dimetyyli-P-fenylendiamiini tai p-amynodimetylaniiliini p-amokorhydraatti. Se valmistetaan kuten Kovacs -oksidaasireagenssille on kuvattu, korvaamalla kyseinen aine.

Tämä reagenssi on hiukan stabiilempi kuin Kovacs-oksidaasireagenssi, vaikka kaikki penilendiamiinia sisältävät reagenssit ovat epävakaita.

Tämä reaktio on myöhässä.

-Nadi -reagenssi

Se koostuu 1%: n aftolista etyylialkoholissa (95% etanoli) ja 1% aminylinissä. Seos valmistetaan yhtä suurina osina ja käyttämällä absoluuttista etyylialkoholia laajentuneena, kunnes riittävä määrä on valmis 100 ml: lle.

-Carpenter Reactive, Suhrland ja Morrison

Se koostuu 1% p-amynodimetyylialaniinioksalaatista. Valmistaudu samalla tavalla kuin Kovacs -oksidaasireagenssille kuvattu, vaihtamalla vastaavalle aineelle.

Voi palvella sinua: viidakon ruokaketju

Liuosvalmiuden ollessa reaktiiviset nauhat valmistetaan seuraavasti: Whatman 6-8 cm numero 1.

Niiden sallitaan kuivua ilman, että heillä on kosketusta metalliin, säästä purkkien lanka kuivausaineella ja pidä jääkaapissa. Nämä nauhat ovat vakaita jopa 6 kuukautta.

Se on kaikkein mainituin stabiilin reagenssi, kyky kestää liuoksessa jopa 6 kuukauteen. Toinen kannattava kohta on, että väliaine ei väri pesäkkeen ympärillä, jos sitä käytetään suoraan levylle.

Punaisen värin ulkonäkö tulkitaan positiivisena testinä.

-Oksidaasilevyt

Ne ovat kaupallisia levyjä, jotka on kyllästetty reagenssilla oksidaasitestissä. Markkinoilla on useita kaupallisia tuotemerkkejä.

Sen käyttö on melko käytännöllistä, koska emme saa valmistella tuoreita reagensseja, mikä helpottaa työtä. Saadut tulokset ovat luotettavia, kunhan levyt säilytetään oikein.

Protokollat

Suora levymenetelmä, epäsuora menetelmä paperille ja kyllästettyjen levyjen käyttö oksidaasireagenssien kanssa.

-Suora levymenetelmä

Tätä tarkoitusta varten lisätään 2 tai 3 tippaa minkä tahansa edellä mainituista reagensseista, jotka sisältävät viljelyaluslevyn, joka ei sisällä glukoosia.

Pesäkkeiden muutos tai ei väri tulkitaan, ei väliainetta. Kelvollinen reaktioaika riippuu käytetystä reagenssista.

-Epäsuora menetelmä paperilla

Leikkaa pala suodatinpaperia (mitä nro 1) kooltaan 6 cm² Ja se on sijoitettu tyhjän petrin sisään.

Lisää 2 tai 3 tippaa Kovacs -oksidaasireagenssia paperille, osallistu pesäkkeeseen, jota haluat opiskella platinakahvalla tai puisella sauvalla ja laajenna se suorassa linjassa kyllästetyllä reagenssipaperilla. Tulkita 5-10 sekunnin ajanjaksolla.

Puusepän, ​​Suhrlandin ja Morrisonin reagenssin kanssa valmistettujen nauhojen kanssa pesäke ulottuu kuivanauhaan. Sama nauha palvelee kokeilemaan useita kantoja. Tulkita 10 sekunnin ajan.

-Levyt (msuora eTod)

Hienovaraisesti kostuttaa kaupallisia levyjä steriilillä tislatulla vedellä ja voittavan siirtokunnan tutkimiseksi. Levyjä on suositeltavaa käyttää 35 ° C: ssa, jos levyjä käytetään huoneenlämpötilassa tai jäähdytetyissä levyissä, reaktio on vähän hitaampi. Tulkitse värinmuutos välillä 10 - 20 sekuntia.

Veren tai suklaan sisältyviä pesäkkeitä voidaan käyttää.

-Levyt (epäsuora menetelmä)

Kostuttaa albumia yllä kuvatulla tavalla. Aseta se tyhjälle petrille. Ota riittävä määrä pesäkettä opiskelemaan platinakahvalla tai puisella sauvalla ja aseta levylle. Tulkitse värinmuutos välillä 10 - 20 sekuntia.

Käyttää

Neisseria ja Acinetobacter suvut muistuttavat joskus paljon morfologisesti, koska vaikka Acinetobacter -genre on gram -negatiivinen bacillus, se voi joskus omaksua kookosmuodon ja levittää pareittain, simuloimalla Neisseria -sukua.

Voi palvella sinua: limnologia

Tässä tapauksessa oksidaasitesti on todella hyödyllinen. Sukupuoli Neisseria on positiivinen ja negatiivinen acinetobacter.

Suku Moraxella on kuitenkin hyvin samanlainen kuin Neisseria -suku ja molemmat antavat positiivisen reaktion; Siksi meidän on aina suoritettava hiilihydraattien käymistestejä lopullista tunnistamista varten.

Toisaalta oksidaasitesti on hyödyllinen muiden fermerien Enterobacteriaceae -perheeseen (kaikki negatiivisen oksidaasi), kuten Pasturel -sukuun, Aeromones, Plesiomonas (positiivinen oksidaasi), erottua bakteeria (kaikki negatiiviset oksidaasi), joka kuului bakteeriin (kaikki negatiiviset oksidaasi), kuten negatiivinen oksidaasi).

Sukuvibrio ja Helicobacter ovat myös positiivisia oksidaasi.

QA

Käyttää tunnettuja kantoja Escherichia coli negatiivisena kontrollina ja Pseudomonas aeruginosa positiivisena kontrollina.

Rajoitukset

-Reagensseja on käytettävä vasta valmisteltavana, niiden käyttöikä huoneenlämpötilassa on lyhyt siitä, että ne ovat erittäin epävakaita. Jäähdytetty voi kestää 5 päivästä 2 viikkoon.

-Reagenssit ovat värittömiä, jos ne muuttavat väriä, ne on hylättävä. Vaurioituneet levyt ovat ilmeisiä, koska ne ovat pimeässä ajan myötä.

-Positiivista reaktiota KOVACS: n oksidaasireagenssin kanssa välillä 15–60 sekunnin ajan pidetään viivästyneenä reaktiona, ja 60 sekunnin kuluttua sitä tulisi pitää negatiivisena.

-Hän Haemophylus influenzae Se antaa negatiivisen oksidaasireaktion, jos käytetään reagenssia dimetyyli-P-fenylendiamiinin kanssa, mutta positiivista, jos KOVACS: n oksidaasireagenssia (tetrametyyli-P-fenylendiamiini) käytetään hyödyllistä).

-Media, joka sisältää glukoosin häiritsemistä testissä, virheellisesti negatiivinen.

-Kuin Bordetella pertussis Ne voivat antaa virheellisesti positiivisen reaktion, jos ne ovat kotoisin hyvin konsentroituneista veriagar -levyistä.

-Metallikahvojen (rauta) käyttö antaa virheellisesti positiivista reaktiota.

suositukset

-Koska reagenssit ovat erittäin epävakaita ja yleensä itse.

-Toinen tapa viivästyttää reagenssin itsehapsia on lisätä 0,1% askorbiinihappoa reagenssien valmistushetkellä.

-Koska reagenssit ovat epävakaita, on suositeltavaa suorittaa viikoittainen laadunvalvonta.

-Reagensseja, jotka eivät läpäise laadunvalvontakoetta.

Viitteet

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. ed. Pan -American toimitus.-Lla. Argentiina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott -mikrobiologinen diagnoosi. 12 Ed. Pan -American toimitus.-Lla. Argentiina.
3. "Oksidaasitesti." Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. Tammikuu 2018, 10:32 UTC. Huhtikuu 2019, 14:03
4. Maailman terveysjärjestö. Laboratoriokäsikirja kansanterveyden kannalta tärkeiden bakteerien taudinaiheuttajien antimikrobien tunnistamiseksi ja testaamiseksi kehitysmaailmassa.2004. Saatavana osoitteessa: kuka.Int/drugresistence/infoshing
5. Reaktiiviset nauhat oksidaasiaktiivisuuden diagnosoimiseksi bakteereissa. Kuubalainen Rev. 2000; 52 (2): 150-151.