Tekninen rekombinantti -DNA, sovellukset ja perusteet

Hän Rekombinantti -DNA (DNA tai RDNA) on laboratoriossa luotu keinotekoinen nukleiinihappomolekyyli integroimalla kaksi kiinnostavaa organismin segmenttiä. Se tunnetaan myös nimellä kimeerinen DNA hybridi -ominaisuutensa ansiosta. Emme löydä tämän tyyppistä DNA: ta luonnossa.

Perusmenetelmä sen tuottamiseksi sisältää: (a) valkoisen DNA: n valinnan ja sen insertoinnin toiseen DNA -fragmenttiin (yleensä bakteeriplasmidi); (b) Tämän plasmidin käyttöönotto bakteeriin, c) bakteerien valinta antibioottien kautta ja lopuksi (d) geenin ilmentyminen.

Lähde: Pixabay.com

Tekniikka hyödyntää entsyymipeliä, jonka avulla voit kopioida ja liittää spesifiset DNA -fragmentit tutkijan kokeiluun.

Rekombinanttitekniikan tavoite on useimmissa tapauksissa molekyylibiologin toivoman proteiinin (tunnetaan nimellä rekombinanttiproteiinin) ilmentyminen tulevia tutkimuksia varten tai luoda kaupallista ja terapeuttista arvoa - kuten esimerkiksi ihmisen insuliini, esimerkiksi ihmisen insuliini, esimerkiksi ihmisen insuliini.

[TOC]

Rekombinantti -DNA -tekniikan perusteet ja sen käyttö geenitekniikassa

Molekyylibiologian keskeinen dogma

Kaikilla tiedossa olevilla orgaanisilla olennoilla on useita ominaisuuksia. Yksi niistä on geneettisen materiaalin luonne ja tapa, jolla proteiineja tuotetaan - prosessi, joka tunnetaan molekyylibiologian keskeiseksi "dogma".

Lukuun ottamatta viruksia paria, kaikki organismit tallentavat geneettistä tietoa DNA: ssa (deoksiribonukleiinihappo), kerätty erittäin kompakti ja organisoitu soluykkeeseen.

Geeniekspressiota varten DNA -molekyyli transkriptoidaan Messenger -RNA: lle ja jälkimmäinen transloidaan aminohappikieleksi, proteiinien rakenteelliset lohkot.

Mikä on rekombinantti -DNA?

70- ja 80 -luvun välillä molekyylibiologit alkoivat hyödyntää solun sisällä luonnollisesti tapahtuvia prosesseja ja onnistuivat ekstrapoloimaan ne laboratorioon.

Tällä tavalla eläingeeni (esimerkiksi selkärankaiset) voitaisiin asettaa Bakteerien DNA -segmenttiin; tai bakteerin DNA voitiin yhdistää virus -DNA: n kanssa. Siten voimme määritellä rekombinantti -DNA: n molekyyliksi, joka koostuu kahdesta eri organismista DNA: sta.

Kun tämä hybridi- tai rekombinanttimolekyyli on luotu, jatkamme kiinnostuksen geenin ilmentymistä. Sanalla ilmaisu Haluamme viitata proteiinin translaatioprosessiin.

Voi palvella sinua: Monohíbrid

Rajoitus- ja liigaentsyymit: Avain prosessiin

Keskeinen elementti rekombinantti -DNA -tekniikan kehittämiseen oli restriktioentsyymien löytäminen.

Nämä ovat proteiinimolekyylejä, joilla on kyky jakaa DNA: ksi (nukleas) betonisekvensseissä, jotka toimivat "molekyylisissä saksina". Näiden entsyymien tuottamia fragmentteja kutsutaan restriktiofragmenteiksi.

Nämä entsyymit voivat tuottaa valkoisessa sekvenssissä symmetrisiä leikkauksia (molemmissa ketjuissa samalla korkeudella) tai epäsymmetriset leikkaukset. Restriktioentsyymien vaikutuksen keskeinen näkökohta on, että ketjujen jakamisen jälkeen saadaan "löysä reuna", täydentävänä toisella reunalla, joka on leikattu samalla entsyymillä.

Joitakin esimerkkejä ovat ECOR 1 ja SMA 1. Yli 200 tyyppiä restriktioentsyymejä on tällä hetkellä tiedossa, ja ne ovat kaupallisesti saatavissa.

Jotta sakset olisivat hyödyllisiä, liiman on liitettävä. Tämä DNA: n tiivistysvaikutus (aiemmin käsitelty restriktioentsyymeillä) suorittaa liigat.

Tekniikka: Kuinka organismin DNA on laboratoriossa muokattu keinotekoisesti?

Seuraavaksi kuvaamme rekombinantti -DNA -tekniikan edellyttämät päävaiheet. Kaikkien ammattilaiset suorittavat molekyylibiologian laboratoriossa.

Mikä on "klooni"?

Ennen kokeellisen protokollan jatkamista on huomattava, että molekyylibiologiassa ja bioteknologiassa termiä "klooni" ja verbi "klonar" käytetään laajasti. Tämä voi johtaa sekaannukseen.

Tässä yhteydessä emme viittaa kloonaukseen kaikki Organismi (kuten esimerkiksi kuuluisan Dolly -lampaiden tapauksessa), mutta DNA -fragmentin kloonaamiseen, joka voi olla geeni. Eli tuottaa monia kopioita - geneettisesti identtinen - sekvenssistä.

1. Eristäminen ja DNA: n saaminen

Ensimmäinen askel on päättää, mikä sekvenssi haluaa käyttää. Tämä riippuu täysin tutkijan ja hänen työnsä tavoitteista. Sitten tämä DNA on eristettävä ja puhdistettava. Menetelmät ja menettelyt tämän saavuttamiseksi riippuvat organismista ja kudoksesta.

Osa kudoksesta otetaan yleensä ja käydään hoidossa hajotusharrastamisessa. Myöhemmin geneettisen materiaalin pirstoutuminen pieniin fragmentteihin jatketaan.

2. Kloonausvektori

Valmistusvaiheiden jälkeen tutkija pyrkii esittämään kiinnostuksen kiinnostavan DNA -segmentin kloonausvektoriin. Tästä eteenpäin tähän DNA -segmenttiin kutsumme sitä valkoiseksi DNA: ksi.

Se voi palvella: Dominant Geeni: Geneettiset periaatteet, tutkimusmenetelmät, tekijät

Plasmidit

Yksi bakteerien alkuperän plasmidin eniten käytetyistä vektoreista. Plasmidi on kaksoisketjuinen pyöreä DNA -molekyyli, jonka löydämme luonnollisesti bakteereista. Ne ovat kokonaisuuksia bakteerikromosomin ulkopuolella - toisin sanoen ne ovat ekstromosomaalisia, ja niitä esiintyy luonnollisesti näissä prokaryooteissa.

Vektorin peruselementit ovat: (a) replikaation alkuperä, joka mahdollistaa DNA -synteesin; (b) valintaaine, joka mahdollistaa organismien tunnistamisen, jotka kuljettavat plasmidia valkoisella DNA: lla, kuten resistenssi antibiootille; ja (c) moniklonaatiokohde, josta löydetään sekvenssit, jotka tunnistetaan restriktioentsyymeillä.

Ensimmäinen onnistunut rekombinantti -DNA laboratoriossa kloonattiin bakteerien PSC101 -plasmidiin JA. koli. Tämä sisältää restriktiokohdan ECORI -restriktioentsyymeille ja resistenssigeenille antibiootille replikaation alkuperän lisäksi.

Valkoisen DNA: n asettaminen plasmidiin tehdään käyttämällä edellisessä osassa kuvattuja restriktioentsyymejä ja liigaita molekyylityökaluja.

Merkittäviä vektorityyppejä

Plasmidien lisäksi DNA voidaan asettaa toiseen vektoriin, kuten lambda -bakteriofagiin.

3. Rekombinantti -DNA: n käyttöönotto

Kun rekombinantti -DNA -molekyyli (kiinnostava geeni plasmidissa tai muussa vektorissa) on saatu.

Käytetään bakteeriin, jota kutsutaan bakteerimuutokselle, vieraiden DNA: n esittämiseksi bakteerien transformaatiota, jossa keho esitetään käsittelyyn kaksiarvoisilla kationilla, mikä tekee siitä alttiita DNA: lle ottamiselle.

Metodologisesti emme voi varmistaa, että 100% sadon bakteereista on ottanut tehokkaasti rekombinantti -DNA -molekyylin. Täällä antibioottiresistenssiä sisältävä plasmidin osa tulee peliin.

Siten plasmidin ottaneet bakteerit ovat resistenttejä tietylle antibiootille. Niiden valitsemiseksi riittää mainitun antibiootin levittämiseen ja eloonjääneiden ottamiseen.

4. "Sadonkorjuu" proteiini

Valittuaan bakteerit rekombinantti -DNA: lla, jatkamme isäntäentsymaattisia koneita kiinnostavan proteiinituotteen tuottamiseksi. Kun bakteerit toistetaan, plasmidi kulkee jälkeläisilleen, joten se ei mene kadota jaon aikana.

Tämä menettely käyttää bakteereja eräänlaisena ”tehtaalla” proteiinia. Myöhemmin näemme, että se on ollut erittäin merkityksellinen toimenpide tehokkaiden lääketieteellisten hoitomuotojen kehittämisessä.

Voi palvella sinua: Telophase: Mikä on mitoosissa, meioosissa

Kun sato on valmis ja bakteerit ovat tuottaneet suuria määriä proteiineja, solun solu tai repeämä on. On olemassa laaja valikoima biokemiallisia tekniikoita, jotka sallivat proteiinien puhdistuksen niiden fysikaalisten kemiallisten ominaisuuksien mukaisesti.

Toisessa kokeellisessa tilanteessa emme ehkä ole kiinnostuneita proteiinin luomisesta, mutta olemme kiinnostuneita DNA -sekvenssin saamisesta sinänsä. Jos niin olisi, plasmidi palvelisi meitä kiinnostavan fragmentin useita kopioita tavoitteena olla riittävä määrä valkoista DNA: ta asiaankuuluvien kokeiden suorittamiseksi.

Sovellukset

Rekombinantti -DNA -tekniikka avasi äärettömän määrän mahdollisuuksia molekyylibiologiaan, bioteknologiaan, lääketieteisiin ja muihin siihen liittyviin alueisiin. Erinomaiset sovelluksesi ovat seuraavat.

Geneettinen analyysi

Ensimmäinen sovellus liittyy suoraan molekyylibiologian laboratorioihin. Rekombinantti -DNA -tekniikka antaa tutkijoille mahdollisuuden ymmärtää geenien normaalin toiminnan, ja tuotettuja proteiineja voidaan käyttää seuraavassa tutkimuksessa.

Lääketeollisuus

Rekombinantti -DNA -menettelyä käyttämällä tuotetut proteiinit ovat sovelluksia lääketieteessä. Kaksi erittäin merkityksellistä esimerkkiä kentällä ovat ihmisen insuliini ja kasvuhormoni, jota käytetään potilailla, joilla ei ole tällaista proteiinia.

Rekombinantti -DNA: n ansiosta nämä proteiinit voidaan tuottaa ilman tarvetta erottaa toisesta ihmisestä, mikä edustaa ylimääräisiä metodologisia komplikaatioita ja terveysriskejä. Tämä on auttanut parantamaan lukemattomien potilaiden elämänlaatua.

Viitteet

1. Baca, l. JA. Lens., & Álvarez, C. Lens. C. (2015). Biologia 2. Patria -toimitusryhmä.
2. Cooper, G. M., Hausman, r. JA., & Hausman, R. JA. (2000). Solu: lähestymistapa molekyyli (Vol. 10). Washington, DC: ASM Press.
3. Devlin, t. M. (2004). Biokemia: Oppikirja kliinisillä sovelluksilla. Käännyin.
4. Khan, S., Ullah, m. W -., Siddique, r., Nabi, G., Manan, s., Yousaf, m., & Hou, h. (2016). Rekombinantti -DNA -tekniikan rooli elämän parantamiseksi. Kansainvälinen Genomian lehti, 2016, 2405954.
5. Mindan, f. P., & Mindan, P. (1996). Patologinen anatomia. Elsevier Espanja.
6. Tortora, G. J -., Funke, b. R -., & Tapaus, c. Lens. (2007). Johdanto mikrobiologiaan. Ed. Pan -American Medical.
7. M. J -. (1989). Ihmisen insuliini: DNA -tekniikan ensimmäinen lääke. American Journal of Health-System -apteekki, 46(11_Suppl), S9-S11.