Puoliksi Löwenstein-Jensen-säätiö, valmistelu ja käyttö

Hän Keskimmäinen Löwenstein-Jensen Se on selektiivinen kiinteä väliaine Mycobacterium -suvun bakteerien, kuten Mycobacterium tuberkuloosi, M. Avium, Muun muassa, lukuun ottamatta Leprae -lajeja, joita ei voida viljellä.

Mycobacterium -suvun bakteerit eivät kasva tavanomaisissa viljelyväliaineissa, joten oli välttämätöntä suunnitella erityinen keino sen eristämiseen. Alkuperäisen välineen on luonut Löwenstein, ja sitten Jensen muutti sitä.

Puoli Löwenstein-Jensen Mycobacterium tuberculosis -pesäkkeiden kanssa. Lähde: Agarwal et ai / Biomed Central Ltd., Biologian kuvakirjaston kohteliaisuus

Modifikaatio koostui Kongon punaisen väriaineen eliminoinnista korvaamalla sen malakiitin vihreän suurempaan pitoisuuteen. Se muutti myös magnesiumsitraatin ja monopotaasisen fosfaatin pitoisuuksia.

Löwenstein-Lose-elatusaine sisältää tällä hetkellä papaaatti tärkkelyksen, asparragiinin, magneettisen sitraatin, monopofosfaatin, magneettisen sulfaatin, malakiitin vihreän, nalidíxico-hapon, sykloheksimidin.

Mykobakteerit ovat yleensä eristetty sivustoista, jotka eivät ole steriilejä, kuten yskö, virtsa, paiseet, muun muassa. Tämä tarkoittaa, että useimmat näytteet sisältävät alueen tavanomaisen mikrobiotan sekä patogeenin.

Siksi Löwenstein-Jensen-väliaine sisältää sarjan estäjiä koostumuksessaan, jota edustavat malakiittivihreät, antibiootit ja antifungaalit.

Lisäksi näytteitä, jotka tulevat muusta kuin sterilisestä alueelta.

[TOC]

Perusta

Munan ja glyseriinin läsnäolo Löwenstein-Jensen-elatusaineessa stimuloi mykobakteerien kasvua, koska ne tarjoavat rasvahappoja ja proteiineja, joita tarvitaan näiden mikro-organismien kehittämiseen.

Löwenstein-Jensen-väliaine sisältää Malachite Greeniä, joka on mukana oleva mikrobiota-estäjä. Mutta se sisältää myös nalidíhirathappoa (35 ug/ml), joka estää gram -negatiivista mikrobiotaa, sykloheksimidiä (400 ug/ml), joka estää saprofyyttejä sieniä ja hiivoja, ja lynching (2µ/ml), mikä estää mikrobiota Gram Positiivista.

Jotkut kaupalliset talot mieluummin lisäävät seuraavan antibioottien yhdistelmän: Polymixina B 200.000 yksikköä/l, amfoterisiini B 10 mg/l, karbenisilliini 50 mg/l ja tripatoprima 10 mg/l.

Tämä väliaine ei sisällä agaria, joten väliaineen kiinteyttäminen tapahtuu munassa läsnä olevan albumiinin hyytymisellä steriloinnin aikana.

Valmistautuminen

Punnitse 37,3 g dehydratoitua elatusainetta 600 ml: n tislattua vettä, joka on aiemmin lisätty 12 ml glyserolia. Seosta lämmitetään, sekoitetaan usein sen kokonaisliukenemiseen asti. Autoklaari väliaine 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan.

Voi palvella sinua: ihmisen kehityksen 12 vaihetta ja sen ominaisuuksia

Toisaalta aseptisissa olosuhteissa tulisi valmistaa 1000 ml tuoretta munaa homogeeninen suspensio. Lisää munasuspensio 600 ml: n lämpötilassa, joka on valmistettu lämpötilassa 50 - 60 ° C, välttäen ilmakuplia.

Antibioottiratkaisut lisätään myös autoklaaven steriloinnin jälkeen.

Kaada väliaine steriileihin testiputkiin kierteellä. Kuumenna putket 85 ° C: ssa 45 minuutin ajan kaltevassa asennossa.

Valmistetun väliaineen väri on Aguamarine Green ja voi olla valkeahkoja muna -lipidien läsnäoloa.

Keskipitkän pH: n on oltava 7,2 ± 0,2

Tallenna jääkaappiputket ja suojattu suoralta valolta käyttöön. Uppoaa ennen kylvöä.

Löwenstein Jensenin gruft -modifikaatio "modifikaatiota väliainetta" modifikaatio ". Tämä sisältää samat yhdisteet kuin klassinen väliaine, mutta RNA-5mg/100 ml lisätään, ja estäjinä se sisältää malakkiitin vihreää 0,025 g/100 ml, penisilliiniä 50 U/ml ja nalidíxico 35 ug/ml happoa.

Sovellukset

Löwenstein-Jensen-väliainetta käytetään mykobakteerien eristykseen erityyppisistä näytteistä. On suositeltavaa suorittaa Ziehl-Neelsen-värjäys mihin tahansa näytteeseen, jossa epäillään mykobakteerien läsnäoloa.

Jotkut näytteet ovat peräisin steriileiltä sivustoilta, mutta toiset eivät. Muiden kuin stiilien näytteet on puhdistettava tapauksen mukaan:

Yskö

Yskönäytteet on puhdistettava seuraavasti: Määritä ysköksenäytteen määrä ML: ssä ja lisää sama määrä 4% NaOH: ta ja Incube: ta 37 ° C: seen.

Ravista seosta usein 30 minuutin aikana. Sen jälkeen sentrifugue nopeudella 3000 rpm 30 minuutin ajan.

Hävitä supernatantti fenolisesta desinfiointiaineesta. Käytä kylvää sedimenttiä, mutta ensin pH on neutraloitava.

Sedimentin neutraloimiseksi H -käytetään₂Sw₄ 5%: lla punaisen fenoli -indikaattorin läsnä ollessa, kunnes se johtaa neutraaliin pH: hon, joka on peräisin lohenväristä.

Mahalaukun pesu, keuhkoputken pesu ja keuhkoputken aspiraatti

Tässä tapauksessa näytteen tulisi sentrifugoi nopeudella 3000 rpm 30 minuutin ajan. Supernatantti hylätään ja sedimenttiä käytetään. Sedimentin puhdistamiseksi lisätään 3 ml 4 -prosenttista NaOH: ta ja sekoitetaan usein 37 ° C: ssa puolen tunnin ajan.

Voi palvella sinua: stroma (histologia)

Sentrifugi jälleen, supernatantti hylätään ja sedimenttiä käytetään. Jälkimmäinen on neutraloita.

Virtsa

Anna näytteen jääkaapissa 24 tunnin ajan. Erota supernatantti. Jäljellä oleva sedimentti on sentrifugoitava 30 minuutin ajan 3000 RMP: llä. Hävitä supernatantti uudelleen ja palauta sedimentti 3 ml: lla steriiliä fysiologista liuosta.

Lisää 3 ml 4% NaOH: ta ja siirry puhdistamiseen ja neutralointiin, kuten aiemmin on kuvattu.

Assiittinen neste, keuhkopussin neste, aivo -selkäydinneste

Tämän tyyppisessä näytteessä se sentrifugoituu ja supernatantti hylätään. Tee gramma sedimenttiin tai tarkkaile suoraan mikroskoopissa; Jos bakteereja ei havaita, puhdistamisen läpäisy ei ole välttämätöntä eikä neutralointi.

Tässä tapauksessa näyte voidaan kylvää suoraan sedimentillä. Jos bakteereja on, jatka puhdistamaan ja neutraloimaan edellä kuvatulla tavalla.

Biopsiat

Tämäntyyppinen näyte tulisi lisätä 5 ml tislattua vettä myöhemmin sentrifugiin nopeudella 1500 rpm 10 minuutin ajan. Hävitä supernatantti ja sentrifugoi sedimentti nopeudella 3500 rpm 30 minuutin ajan. Käytä sedimenttiä kylvää viljelyalusta.

Hiofare -kurkunpään

Työpöytä on tuotava steriiliin putkeen, joka sisältää yhtä suuret osat tislattua vettä ja 4% NaOH: ta. Pyyhke on painettava putken seiniin siten, että näyte laimennetaan nesteessä. Sentrifugit ja käytä sedimenttiä. Neutraloi sedimentti, kuten jo on jo kuvattu.

Kylvää

Löwenstein-Jensen-väliaine inokuloidaan lisäämällä 0,5 ml näytettä väliaineen pinnalle. Kierrä putkea jakautuaksesi näytteen koko väliaineen ajan. Älä käytä platinakahvaa.

Voit kylvää toisen putken, joka sisältää puoli kivihankin eristääkseen Mycobacterium bovis ja muut lajit, jotka eivät kasva Löwenstein-Jensen-ympäristössä.

Inkubointi

Inokuloituja putkia inkubidaan aerobioosissa 37 ° C: ssa, hiukan laiska kansi ja kallistetaan noin 5 °: ssa ja suojattu valolta. Ympäristö hiilidioksidilla voidaan rikastuttaa 5-10%: lla. Tarkista kasvit kahdesti viikossa, kunnes siirtokunnat ilmestyvät.

Se voi palvella sinua: nenän erikseen: mihin se on, menettely, viljely

Kun näyte on absorboitu, tapas säädetään. Suurin inkubaatioaika on 8 viikkoa, jos tämän ajan kuluttua kasvua ei ilmoiteta negatiiviseksi.

QA

Laadunvalvontana voit käyttää seuraavia kantoja:

Mycobacterium tuberkuloosi ATCC 27294,  Mycobacterium Kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Kolme ensimmäistä mainittua lajia on odotettavissa erinomaisen kehityksen M. Fortutum Kasvun on oltava hyvä, kun taas M. Bovis odotetaan vähäistä tai nollakasvua. Kun taas muut lajit kuin Mycobacterium -suvut on estettävä kokonaan.

Rajoitukset

Valmistetun väliaineen on suojattava itseään valolta, pitkittynyt valo valolle tekee keskipitkästä Virestä vihreästä siniseen, tässä tapauksessa väliainetta ei voida enää käyttää. Tämä johtuu siitä, että Malachite's Green on valoherkkä.

Elatusaine, koska se sisältää munaa, voi olla helposti saastunut, jos sitä ei manipuloida aseptisesti. Se voidaan liuottaa, jos se on saastunut proteolyyttisillä bakteereilla.

Mycobacterium -suvun bakteerien viljely ja manipulointi vaatii pätevää henkilöstöä, joka on tietoinen bioturvallisuustoimenpiteistä, jotka on toteutettava saastumisen tai muiden saastumisen välttämiseksi.

HCL: ää ei tule käyttää neutraloinnin läpikäynnissä natriumkloridin muodostumisen vuoksi, mikä voi olla myrkyllistä Koch Bacillukselle.

Näytteet on pidettävä jäähdytettynä ja suojattava valolta niin kauan kuin niitä ei käsitellä.

Viite

1. Laboratoriot Francisco Soria Melguizo. 2009. Löwenstein-Jensen-selektiivinen väliaine. Saatavana osoitteessa: F-Soria.On
2. Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen-väliaine. Saatavana osoitteessa: Britanialab.com.
3. Neogen -laboratoriot. Löwenstein-Jensen-väliaine. Saatavana osoitteessa: FoodSefety.Neogen.com.
4. "Löwenstein-Jensenin keskellä." Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 20. marraskuuta 2018, 15:15 UTC. 24. huhtikuuta 2019, 18:34. Wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. ed. Pan -American toimitus.-Lla. Argentiina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott -mikrobiologinen diagnoosi. 12 Ed. Pan -American toimitus.-Lla. Argentiina.
7. Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisen merkityksen bakteerien tunnistamiseksi. 3. ed. Pan -american toimitus. Buenos Aires. Argentiina.