Proteinaasi K -ominaisuudet, entsymaattinen aktiivisuus, sovellukset

Se Proteina k Se on entsyymi, joka kuuluu seriiniproteaasien ryhmään, toisin sanoen sillä on aktiivisessa katalyyttisessä keskuksessa seriinin aminohappo ja sillä on funktiota peptidisidokset hydrolyysillä. Tämä entsyymi puolestaan ​​kuuluu subtilisiiniproteiinien perheeseen (peptidaasi S8).

K -proteinaasin molekyylipaino (PM) on 28.900 daltonia ja eristettiin ensin 1.974 sieni -uutteissa Engyodontium -albumi, aikaisemmin nimellä Tritirachium -albumi Limber.

K -proteinaasin molekyylirakenne. Lähde: Lykchiniadis [CC BY-SA 4.0 (https: // creativecommons.Org/lisenssit/by-SA/4.0)]

Siinä on korkea proteolyyttinen kapasiteetti, joka osoitetaan kykenemällä hajottamaan hiuksissa läsnä olevan keratiinin. Sana keratiini englanniksi on kirjoitettu "keratiiniksi", sieltä tulee, että sitä on kutsuttu "proteinsa k".

Koska alkuperäiset proteiinit jakautuvat voimakkaasti, tämä entsyymi on hyödyllinen molekyylibiologian erilaisissa tekniikoissa. Käytetään pääasiassa nukleiinihappojen eristämiseen ja valmistamiseen korkean molekyylipainolla (PM).

K -proteinaasi vaikuttaa vapauttamalla ydin -DNA: ta tuhoamalla proteiinit ja inaktiivinen RNaaseille ja dnaattille, toisin sanoen eliminoivat nukleat DNA- ja RNA -valmisteissa.

Toisaalta on nähty, että K -proteinaasi voi hydrolysoitua joitain denaturoituja natiiviproteiineja, mikä on kiinnittänyt tutkijoiden kiinnostusta käytettäväksi prioniproteiinien tutkimuksessa (PRPC).

Huolimatta siitä,. Niistä on joitain epänormaaleja proteiineja, joita kutsutaan prioneiksi (PRPSC), jotka liittyvät siirrettäviin spongiformiin enkefalopatioihin.

[TOC]

Proteinaasi K: n ominaisuudet

K -proteinaasissa on kolmen kerroksen tertiäärinen rakenne, jossa on seitsemän lääketieteellistä ketjua kahden potkurikerroksen välillä. Peptidaasien perheeseen kuulumisen S8 on ominaista esittämällä katalyyttinen triadi sen aktiivisessa kohdassa, jonka peräkkäinen järjestys on (ASP, His ja olento), joka erottaa ne muista peptidaasiperheistä.

Se voi palvella sinua: proteiiniaminohapot

Tälle seriiniproteaasiryhmän entsyymille on ominaista hydrolysoivat peptidisidokset lähellä alifaattisten ja aromaattisten aminohappojen karboksyyliryhmää.

Toisaalta se kykenee toimimaan tiettyjen syövyttävien aineiden, kuten natriumdodekilsulfaatin (SDS), Tris-HCl ja EDTA, läsnä ollessa, joita käytetään proteiinien denaturointiin aiheuttaen heille menettämään alkuperäisen rakenteensa.

Tämä on aikaisempi vaihe proteiinien valmistuksessa elektroforeesitekniikalle. PH -alue, johon K Proteinsa toimii, on melko leveä (2.0 - 12.0), optimaalisen pH: n välillä 7.5–12.0, ja sen isoelektrinen kohta on 8.9. Kuten voidaan nähdä, se on aktiivinen erittäin laajan pH: n suhteen.

Toinen ominaisuus, joka erottuu K -proteinaasissa, on sen stabiilisuus korkeiden lämpötilojen läsnä ollessa (50 - 60 ° C).

Entsymaattinen aktiivisuus

K Proteinsa tarvitsee kalsiumionin esiintymisen, vaikka se ei vaikuta sen aktiivisuuteen, jos on välttämätöntä säilyttää sen stabiilisuus.

K -proteinsan suorittamiseksi substraatin täydellisen ruuansulatuksen suorittamiseksi likimääräinen kosketusaika on välttämätön 5 minuutin välillä 2 tuntiin.

Tässä mielessä Daza ja yhteistyökumppanit vertasivat kuitenkin useiden valotusaikoina K -proteinaasia vastaan ​​saadun DNA: n puhtautta ja päättelivät, että pitkäaikainen inkubointi (jopa 24 tuntia) parantaa merkittävästi DNA: n laatua.

Nyt suhteessa K -proteinaasientsyymin käytettyyn konsentraatioon eri protokollissa voidaan sanoa, että se on hyvin monipuolinen.

Sitä voidaan käyttää erittäin alhaisista pitoisuuksista (5 ug/ml) 500 ug/ml pitoisuuksia. Mutta yleisimmät työpitoisuudet ovat välillä 50-100 μg /ml, etenkin proteiinien sulamisessa ja nukleassa. Vaikka kudoksen käsittelyä varten tarvitaan pitoisuus 2 mg/ml.

Voi palvella sinua: Easmotherium Sibiricum: Ominaisuudet, elinympäristö, fossiilit

Sovellukset

Niiden sovellukset ovat erittäin laajoja ja ne voidaan tiivistää seuraavassa:

-Sitä käytetään proteiinien sulamisessa ja DNA: n uuttossa useilla menetelmillä, kuten: suolaaminen, PK-SDS, äätyylitrekyyli-ammonium (CTAB), modifioitu kaliumasetaatti ja natriumjodidin uuttoasetaatti.

-Nukleaasien inaktivointi (RNASA ja DNASA).

-Hybridisaatiotekniikassa In situ (Hänen), nukleiinihapon vapauttamisen auttamiseksi ei -toivottujen proteiinien eliminoinnin lisäksi.

-Proteiinimodifikaatio.

-Tutkimustasolla, useissa tutkimuksissa.

K -proteinaasin edut

DNA: n uuttotekniikoiden välillä on tehty erilaisia ​​vertailevia tutkimuksia, joissa käytetään K -proteinaasia, muiden kanssa, jotka eivät käytä sitä, ja kaikki päättävät, että entsyymiä käytetään suurempia etuja. Edujen joukossa voidaan mainita:

-Saadaan korkea molekyyli-, korkealaatu- ja puhtaus -DNA.

-Uutettu DNA on vakaa jopa 3 kuukautta.

Uuttettua DNA: ta voidaan käyttää seuraavissa tekniikoissa: eteläinen blot, polymeraasiketjureaktio (PCR), elektroforeesi, muun muassa.

Proteinaasiresistentit K -proteiinit

Eri tutkimuksissa on päätelty, että prionit (myrkylliset PRPSC: n poikkeavat proteiinit eroavat PRPC: stä (natiivi) proteiineista, jotka ovat resistenttejä K -proteinaasin vaikutukselle, kun taas PRPC: t ovat herkkiä niiden vaikutukselle.

Muut kirjoittajat ovat kuvanneet, että PRPSC: n rakenteessa on herkkiä osia ja muut, jotka ovat resistenttejä K -proteinaasille. Molemmat osapuolet ovat kuitenkin yhtä myrkyllisiä ja tarttuvia.

Toisaalta Bastian ja yhteistyökumppanit vuonna 1987 eristettiin 4 proteiinia 28, 30, 66 ja 76 kDa eräänlaisesta Spiroplasma Mirum. Kaikki osoittautuivat kestäviksi K -proteinaasin vaikutukselle ja niillä oli myös ristikonktio joidenkin prionien kanssa.

Voi palvella sinua: kemotoxis

On tiedossa, että tämä laji voi aiheuttaa tärkeitä kaihia ja neurologisia vaurioita, ja Bastianin tieteellisten havaintojen vuoksi muun muassa se on yrittänyt liittyä tähän mikro -organismiin, jolla.

Tämän degeneratiivisen neurologisen patologian etiologia kuitenkin on kuitenkin tällä hetkellä johdettu prioneille.

Tässä mielessä Butler ja yhteistyökumppanit tunnistivat ja karakterisoivat luokan 40 kDa KDA -proteinaasiresistentistä kahdesta kannasta kahdesta kannasta Mycoplasma hyorhinis. Tämä patogeeni vaikuttaa sikoihin, tartuttaen heidän kudoksiaan, mutta tässä tapauksessa ristireaktiota ei ollut testattujen vankiloiden kanssa.

Lisää tutkimusta tarvitaan monien tuntemattomien selvittämiseksi tässä suhteessa.

Viitteet

1. Bastian F, Jennings R ja Gardner W. 1987. Antiseerumi scrapie-assocted fibrill -proteiiniristirekisteröintien kanssa Spiroplasma Mirum Fibrilliproteiinit. J -. Klinikka. Mikrobioli. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, kuningas J, Ruiz V. Tunnistamattomien ruumiiden formaldehydiin kiinnitetyn lihaskudoksen DNA -uutto- ja puhdistusmenetelmän arviointi.  Lääketieteellinen, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E ja McGarrity G. Proteiini K-resistenttien proteiinien tunnistaminen ja karakterisointi luokan mollicutes-jäsenissä.  Infektio ja immuniteetti, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Marcoima A, Herrera L, et ai. Kahden DNA: n uuttoprotokollan vertailu Trypanosoma Cruzi viljelty axhenic -väliaineessa. Rev. Peru. Lääketieteellinen. Exp. Kansanterveys  2014; 31 (2): 222-227. Saatavana osoitteessa: Scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E ja Palma W. Viiden DNA: n uuttoprotokollan tehokkuuden määrittäminen parafined -materiaalista molekyylitutkimuksiin. Rev Méd Medic Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.