DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-fenylindoli) Ominaisuudet, säätiö, käyttö

Hän DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindoli) Se on väriaine, että sen fluoresoivalla ominaisuudella on merkkinä, jota käytetään laajasti mm. Fluoresenssi- tai virtaussytometriamikroskopiatekniikassa. Sen säteilevä fluoresenssi on kirkkaan sininen, sen jännitys tapahtuu välillä 455-461 nm (UV-valo).

DAPI -väriaine voi ylittää solukalvon kuolleista soluista erittäin helposti. Voit myös värjätä elävien solujen ytimiä, mutta tässä tapauksessa tämän pitoisuuden on oltava suurempi.

Fluoresoivan dystin kemiallinen rakenne. Lähde: Kuva: Tiedosto: DAPI.SVG on tämän tiedoston vektoriversio. Sitä tulisi käyttää tämän rasterikuvan sijasta, kun ei alempi/Richard Wheeler (Zephyris) [CC BY-SA 3.0 (http: // creativecommons.Org/lisenssit/by-SA/3.0/)] muokattu kuva

Väriaine pystyy pääsemään solu -DNA: han, jonka kautta sillä on erityinen affiniteetti, liittyy suurella aviditeettillä adeniini- ja tymiinin typpipohjoihin. Tästä syystä se on erittäin hyödyllinen joissain molekyylibiologian tekniikoissa.

Tämä yhdiste kuuluu indolisten väriaineiden ryhmään, ja sen on osoitettu olevan suurempi herkkyys DNA: lle kuin etidiumbromidi ja propidious jodidi, etenkin agaroosigeeleistä.

Tämän fluoresoivan väriaineen käyttö on erittäin laaja, koska se on hyödyllinen: DNA: n muutosten tutkiminen apoptoottisissa prosesseissa (solukuolema) ja siten havaita solut tässä prosessissa; DNA: n jalanjälkivalokuvalle (DNA: n valokuvatulostus); bakteerien saastumisen tutkiminen; o Visualisoida ydinsegmentointi.

Sitä on käytetty myös kromosomaalisten vyöhykkeiden tutkimuksessa, DNA: n havaitsemisessa Mycoplasmas sp, DNA-proteiini-vuorovaikutuksessa solujen värjäytymisessä ja laskemisessa immunofluoresenssilla ja jopa väritys kypsät siitepölyjyvät.

[TOC]

Ominaisuudet

DAPI on sen kemiallisen nimen lyhenne (4 ', 6-diamidino-2-fenyylindoli). Sen molekyyl kaava on c₁₆H_viisitoistaN_5. Sen molekyylipaino on 350,3. Lähellä UV-valoaluetta (345-358 nm) DAPI-ADN-kompleksin suurin viritys tapahtuu, kun taas suurin fluoresenssipäästö tapahtuu välillä 455-461 nm.

Tälle värialle on ominaista keltainen pöly, mutta tällä fluoroforilla merkityt rakenteet säteilevät kirkkaan sinistä valoa.

Se on kuitenkin vesiliukoinen yhdiste, jotta sen liukenemisen kiihdyttämiseksi voidaan levittää. Se voidaan laimentaa PBS: llä, mutta ei liukene suoraan tähän.

Se voi palvella sinua: arseniosohappo (H3SO3): Ominaisuudet, riskit ja käytöt

Kun väriaine on valmistettu, se on säilytettävä pimeyteen, ts. Suojattu valolta, lämpötilassa 2 - 8 ° C (jääkaappi). Näissä olosuhteissa väriaine on vakaa yli 3 viikkoa tai kuukautta.

Jos valo on suojattu, mutta sen stabiilisuus jätetään huoneenlämpötilassa 2 tai 3 viikkoon, mutta altistuu suorille valolle, heikkeneminen on erittäin nopeaa. Jos haluat säästää paljon kauemmin, voit jäähdytys -20 ° C: ssa jakautuneena alikvooteihin.

Perusta

Tämä värillinen perustuu ydinvoiman vuokraamisen tuottamiseen molekyylibiologian päätekniikoissa, kuten: virtaussytometria, fluoresenssimikroskopia ja metafaasisten kromosomien tai rajapinnan ytimien värjäytyminen.

Tämä tekniikka perustuu suureen affiniteettiin, joka väriaineella on typpimateriaaliin (DNA) sisältäviin typpipitoisiin emäksiin (adeniini ja timiini). Kun taas sytoplasmisella tasolla on hyvin vähän pohjaa.

Kun fluoresoivan väriaineen liitto adeniinia ja Timinaa DNA: n alueille tapahtuu, fluoresenssi kasvaa merkittävästi (20 kertaa enemmän). Sen säteilee väri on kirkkaan sininen. On huomattava, että fluoresenssin päästöjä ei ole sitoutuessaan GC-emäpareihin (guanina-kitosiini).

On tärkeää korostaa, että vaikka sillä on myös affiniteetti RNA: hon, se ei aiheuta ongelmaa, koska tämän molekyylin suurempi energiapäästö tapahtuu toiseen aallonpituuteen (500 nm), toisin kuin DNA, joka tekee sen 460 nm: iin. Lisäksi fluoresenssin lisääntyminen RNA: hon kytkettynä on vain 20%.

DAPI: tä käytetään enemmän väistämään kuolleita (kiinteitä) soluja, jotka elät, koska väriaineen väriaineen väriaineen väriaineen väriaineen väriaineen väriaineen väriaineessa tämä johtuu siitä, että solukalvo on paljon vähemmän läpäisevä DAPI: lle, kun se on elossa.

DAPI -väriainetta voidaan käyttää yhdessä punaisten ja vihreiden fluoroforien kanssa monivärisen kokemuksen saamiseksi.

Käyttää

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindoli) on erinomainen fluorofori, ja sitä siksi sitä käytetään laajasti erilaisissa tekniikoissa ja erilaisiin tarkoituksiin. DAPI: n käyttö selitetään alla päätekniikoissa.

Virtaussytometria

Tutkijat Gohde, Schumann ja Zante vuonna 1978 käyttivät ensimmäistä kertaa ja ehdottivat DAPI: tä fluoroforina virtaussytometriatekniikassa, ja sillä on suuri menestys johtuen suuresta herkkyydestään DNA: n ja sen korkean intensiteetin vuoksi fluoresenssin säteilyssä.

Se voi palvella sinua: aminoharja (NH2): rakenne, ominaisuudet, esimerkit

DAPI: n käyttö tässä tekniikassa mahdollistaa solusyklin tutkimuksen, solujen kvantifioinnin ja elävien ja kuolleiden solujen värjäytymisen.

Vaikka on olemassa muita väriaineita, kuten etidiumbromidi, Hoechst -oksidi, akridiinioranssi ja propidio -jodidi, DAPI on yksi eniten käytettyjen valokuvalaitosten suhteen kuin yllä mainitut.

Tätä tekniikkaa varten se on välttämätöntä. Näyte sentrifugoituu ja supernatantti hylätään.

Vaikka aika siirtää DAPI -väriaineen värjäyspuskurilla (Biolegendin Foxp3) 3 um.

Sentrifugoi näyte, hävitä supernatantti ja peitä sitten 1 ml DAPI -liuosta 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.

Vie näyte virtaussytometriin oikealla laserilla.

Virtausmikrofluorometria

Toinen tekniikka, jossa DAPI: tä käytetään. Molemmat ovat hyödyllisiä kvantifiointiin.

Hybridisaatio In situ 

Tämä tekniikka käyttää periaatteessa fluoresoivalla väriaineella merkittyjä DNA -koettimia, jotka voivat olla DAPI.

Näyte vaatii lämmöllä käsiteltävää kahden luokan DNA: n denaturointia ja muuttamalla se kahteen monokypeeniketjuun. Myöhemmin se hybridisoidaan Dnaisoidulla DNA -koettimella, joka on merkitty DAPI: llä, jolla on kiinnostuksen kohteena oleva sekvenssi.

Myöhemmin se pestiin poistamaan se, mikä ei ollut hibridi, DNA: n visualisointiin käytetään kontrastia. Fluoresenssimikroskooppi mahdollistaa hybridisoidun koettimen havainnon.

Tämän tekniikan tarkoituksena on havaita spesifiset sekvenssit kromosomaalisessa DNA: ssa, kyky diagnosoida tiettyjä sairauksia.

Näistä sito-molekyylitekniikoista on ollut hyödyllistä määrittää yksityiskohdat karyotyyppien tutkimuksessa. Esimerkiksi, se on osoittanut alueet, joissa on runsaasti adenosiini- ja tymiini -emäksiä, joita kutsutaan heterokromaattisiksi alueiksi tai DAPI -nauhoiksi.

Voi palvella sinua: läpäisevyys: käsite, yksiköt, tekijät, esimerkit

Tätä tekniikkaa käytetään laajasti kromosomien ja kromatiinin tutkimiseen kasveissa ja eläimissä, samoin kuin ihmisen synnytyksen ja hematologisten patologioiden diagnoosissa.

Tässä tekniikassa suositeltu DAPI -pitoisuus on 150 ng/ml 15 minuutin ajan.

Jo asennetut dioja tulisi suojata valolta 2-8 ° C: ssa.

Immunofluoresenssin värjäys

Solut on kiinnitetty 4 -prosenttisella paraformaldehydillä. Jos käytetään muita väriaineita, DAPI jätetään lopussa vuokraamana ja PBS -liuos 15 minuutin ajan peitetään. Kun aika kuluu, valmistele DAPI -liuos, joka laimennetaan PBS: llä, niin että lopullinen konsentraatio on 300 um.

Sitten ylimääräinen PBS uutetaan ja peitetään DAPI: llä 5 minuutin ajan. Pese useita kertoja. Arkki havaitaan fluoresenssimikroskoopissa oikean suodattimen alla.

Turva

Tätä yhdistettä on manipuloitava huolellisesti, koska se on yhdiste, jolla on mutageenisia ominaisuuksia. Aktiivihiiltä käytetään tämän vesiliuoksen yhdisteen poistamiseen, jotka hylätään.

Käsikäs, kaapu ja turvalinssit tulisi käyttää tämän reagenssin onnettomuuksien välttämiseksi. Jos kosketus- tai limakosketus tapahtuu, sinun tulee pestä alue tarpeeksi vedellä.

Sinun ei pitäisi koskaan piippata tätä reagenssia suun kanssa, käytä ylivoimaa.

Älä saastuta reagenssia mikrobien aineiden kanssa, koska tämä johtaa virheellisiin tuloksiin.

Älä laimenna DAPI -väriainetta enemmän kuin suositellaan, koska värjäyksen laatu heikkenee huomattavasti.

Älä altista reagenssia suoraan valolle tai pidä lämpöä, koska se vähentää fluoresenssia.

Viitteet

1. Brammer S, Toniazzo C ja Poersch L. Yleisesti yrittäneet kolarit na vihannes sytogenetiikka. Arq. Astia. Bioli. 2015, 82. Saatavana osoitteesta: Scielo.
2. Impath -laboratoriot. Dapi. Saatavana osoitteessa: Menarinidiagnostics.com/
3. Sytokelaboratoriot. 2019. Ohjeet DAPI: n käyttöön. Saatavana Cycellissä.com
4. Elaosegi A, Sabater S. Konseptit ja tekniikat joen ekologiassa. (2009). Toimitukselliset hierot, Espanja. Saatavana osoitteessa: Kirjat.Google.yhteistyö.mennä/
5. Novaes R, rangaistus A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Fluoresenssin käyttö modifioidussa dissektor -menetelmässä sydämen kudoksessa olevien myosyyttien lukumäärän arvioimiseksi. Arq. Rintaliivit. Kardioli. 2012; 98 (3): 252-258. Saatavana osoitteesta: Scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Kasviplasmien läsnäolo papaijoissa (Carica Papaya) Meksikossa. Chapiningo -aikakauslehti. Puutarhanhoitosarja, 2011; 17 (1), 47-50. Saatavana osoitteessa: Scielo.org.